激光技術已深人生命科學的各領域,利用激光能夠在細胞層次和分子層次上研究生命運動。激光技術革新了傳統的顯微成像技術,提高了分辨率,并使細胞微觀結構的立體顯示得以實現;激光技術使細胞、細胞器和細胞表面特性的研究從定性走人定量發展階段,高速分選細胞群體和染色體的技術實現了,世界上第一次建立起了染色體庫,這一技術正在發展成為分子生物學和遺傳學揭開生命奧秘的脫氧核糖核酸(DNA)高速定序技術。x波段激光已經出現,以它為光源的全息技術將改變顯微成像和體現技術和現狀,掀起一場人體透視和細胞成像的技術革命。激光技術在生命科學的發展中起著極重要的作用。
1.直接觀察微觀世界
共焦掃描光學顯微鏡(CSOM)是光學顯微鏡的新的發展方向。在常規顯微鏡中是由物鏡形成物視場的整個放大像,而CSOM是用照明針孔來回掃描物體一點接著一點地成像的。圖描單元圓了+ la 激光穿過針孔以衍射極限光點成像于物鏡的物平面上。從樣品反射的光通過光學系統穿過第二個針孔的而到達探測器。然而,只有當第二個針孔嚴格地位于第一個針孔的共軛像處時,從樣品上該光點反射的光才能到達探測器。樣品的整個像是由光點在物平面上掃描而一點接著一點地形成的。于
外圍光不能穿過探測器針孔,厚樣品的CSOM圖像不舍損失清晰和反差。一點接著一點地成像還有利于計算機處理。利用這些優點,CSOM可以建立物體的三維圖像,只要將掃描獲得的兩維圖像一層層地堆積起來即可。一點接著一點地掃描成像畢竟很耗時,但是通過一個轉盤上咸千千針孔連續地掃描物體,某些CSOM可以進行“實時”顯微。
CSOM正在國際人類染色體計劃中作出卓越的貢獻,該計劃的目的是確定人類DNA內每種基因的定位和化學結構。DNA定序的速度對于該計劃的完成是至關重要的,CSOM能使電泳分析微型化,方法是用光刻掩模和化學刻蝕技術在平面玻璃基底上做成毛細管電泳陣列,CSOM的Ar+激光在DNA移動通過毛細管時掃描DNA,結果表明這種方法比典型的毛細管電泳技術快約10倍。CSOM還可以用來研究在化學溶液中移動和反應的個別分子,可以直接地、實時地看到單個分子的行為。
盡管CSOM有很多優點,它的橫向分辨率仍受到激光的衍射極限寬度的限制,最終與激光的波長有關,約為λ/2。但是,最近一種稱為近場掃描光學顯微鏡(NSOM)的顯微鏡脫穎而出,打破了與波長有關的分辨率這個一度不可逾越的壁晶,NSOM的基本思想是通過很小的針孔照明待觀察的樣品,并將光點掃描樣品。如果針孔小于照明光的波長,并且針孔離樣品僅幾個納米以內(近場),則顯微的分辨率極限主要由針孔直徑確定。現在NSOM已可進行超高分辨率的透射、反射、偏振,折射率和熒光成像,分辨率已達A/20,并可實現超高分辨率光譜學和單分子探測。
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